介紹
在過(guò)去的幾十年中，納米技術(shù)已經(jīng)很好地發(fā)展到構(gòu)建藥物遞送系統(tǒng)，包括但不限于膠束、脂質(zhì)體和納米顆粒[1-10]。與傳統(tǒng)制劑相比，這些納米級(jí)給藥系統(tǒng)（DDS）在提高藥物穩(wěn)定性、防止藥物過(guò)早釋放、改變藥物分布和延長(zhǎng)藥物半衰期方面表現(xiàn)出巨大潛力[11]。因此，它們被廣泛用于各種藥物的輸送，包括抗癌藥物[1，2]，抗菌劑[3，4]和抗炎藥[5，6]等。

納米級(jí)DDS雖然在單藥治療藥物方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，但在提高多病因疾病綜合療效方面仍存在諸多局限性。事實(shí)上，許多常見(jiàn)的臨床疾病是由多種因素相互作用引起的或惡化的。例如，燒傷創(chuàng)面感染常因細(xì)菌感染而加重，例如銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌）和金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）[12]。當(dāng)肝實(shí)質(zhì)和代謝功能的大量喪失誘發(fā)急性肝衰竭時(shí)，患者將變得易感病原體，這在很大程度上限制了晚期緊急肝移植的可行性[13]。另?yè)?jù)報(bào)道，細(xì)菌感染可能是誘導(dǎo)腫瘤形成的主要原因之一， 因此，應(yīng)同時(shí)采用抗癌和抗菌措施治療這些疾病，例如幽門(mén)螺桿菌誘發(fā)的胃癌[14]。因此，為了治療多因素疾病，應(yīng)合理開(kāi)發(fā)DDS，以共同遞送治療劑和抗菌劑，如抗生素[3]、抗菌肽[15，16]、金屬離子[4]和天然化合物[17]。

為此，最常見(jiàn)的策略之一是在一個(gè)制劑中共同遞送兩種或兩種以上的藥物[18，19]。然而，由于納米載體的載藥空間有限，共遞送策略通常無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種藥物的充分載樣[18-20]。最近，聚（異賴氨酸）（PLL）基聚合物已被制造用于封裝帶負(fù)電荷的藥物，例如小分子藥物[21-23]，蛋白質(zhì)[24，25]和核酸[26，27]。值得注意的是，Qiao等人[15]發(fā)現(xiàn)基于PLL的聚合物具有類(lèi)似于普通抗菌肽（AMP）的殺菌機(jī)制，具有去除細(xì)菌感染的巨大潛力。我們之前的研究[16]還表明，多臂PLL（MPLL）具有高抗菌活性、巨大的選擇性和顯著的蛋白水解穩(wěn)定性， 代表了一系列治療耐藥感染的強(qiáng)效抗菌肽[16]。所有這些研究進(jìn)展都預(yù)測(cè)，基于PLL的聚合物不僅可以作為藥物載體，還可以作為具有治療活性的大分子來(lái)協(xié)同治療效果，這意味著納米醫(yī)學(xué)針對(duì)多因素疾病的設(shè)計(jì)有了新的視角。

在這項(xiàng)研究中，設(shè)計(jì)、合成和評(píng)估了MPLL-alt-PEG（方案1）形式的聚乙二醇（PEG）交聯(lián)交替共聚物，作為陰離子藥物遞送和抗菌的平臺(tái)。具有支化聚乙烯亞胺（PEI）核心和聚（i-賴氨酸）外圍鏈的MPLL構(gòu)成了MPLL-alt-PEG共聚物的聚電解質(zhì)段。它們的多臂分子結(jié)構(gòu)具有較高的陽(yáng)離子電荷密度，有利于通過(guò)靜電相互作用增強(qiáng)對(duì)陰離子藥物和細(xì)菌脂質(zhì)雙層的結(jié)合親和力[16]。預(yù)計(jì)MPLL-alt-PEG可以包封陰離子藥物，然后自組裝成殼交聯(lián)聚離子復(fù)合物（PIC）膠束（方案1）。 我們之前的研究表明，殼交聯(lián)膠束可能具有優(yōu)勢(shì)，無(wú)效載藥，提高膠束穩(wěn)定性，并保護(hù)藥物免于過(guò)早釋放和降解[28]。同時(shí)，交聯(lián)后MPLL的抗菌活性也可以提高，因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致分子量、蛋白水解穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期增加[16，29]。載藥MPLL-alt-PEG膠束可以整合負(fù)載藥物的治療效果和載體的抗菌活性。我們證明了MPLL-alt-PEG作為小分子藥物和治療性生物大分子的DDS的可行性，使用水溶性甲基橙（MO）和免疫激素重組人干擾素-a-2b（IFN）作為陰離子模型藥物。隨后 以革蘭陽(yáng)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和革蘭陰性銅綠假單胞菌為模型菌，研究了MPLL-alt-PEG的抗菌活性和機(jī)制。我們預(yù)計(jì)基于MPLL-alt-PEG的納米平臺(tái)可以作為治療細(xì)菌感染涉及多因素疾病的潛在系統(tǒng)。

2.材料與方法
2.1.材料
支化PEI（Mw = 0.8 kDa）是從Sigma-Aldrich（中國(guó)上海）獲得的。g-芐氧羰基-L-賴氨酸（ZLL）購(gòu)自GL Biochem（中國(guó)上海），無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。PEG（琥珀酰亞胺羧甲酯）2（SCM-PEG-SCM，Mw = 7.5 kDa）由JenKem科技有限公司（中國(guó)北京）提供。甲基橙、苯甲醚、甲磺酸、和異硫氰酸熒光素（FITC）均來(lái)自阿拉丁（中國(guó)上海）。Viskase（美國(guó)伊利諾伊州達(dá)連）生產(chǎn)了分子量截止值（MWCO）為7和14 kDa的透析管，而50 kDa和100 kDa的透析管則從Spectrum Laboratories Inc.（美國(guó)加利福尼亞州洛杉磯）購(gòu)買(mǎi)。IFN（500萬(wàn)U）是從安徽安科生物科技有限公司（中國(guó)安徽）獲得的。
2.2.MPLL-alt-PEG共聚物的合成與表征
在PEI引發(fā)的e-芐氧羰基-L-賴氨酸N-羧酸酐（ZLL-NCA）聚合的連續(xù)過(guò)程中合成MPLL-alt-PEG共聚物，以制備PEI接枝聚（e-芐氧羰基-L-賴氨酸）（PEZ），然后與雙官能團(tuán)SCM-PEG-SCM進(jìn)行外圍交聯(lián)，隨后去除芐氧羰基側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)（圖1）。
第一步，根據(jù)我們之前的報(bào)告，ZLL在無(wú)水乙酸乙酯中光氣化（收率：78%）制備ZLL-NCA，然后以PEI為大分子引發(fā)劑聚合d，得到星嵌段共聚物PEZ（產(chǎn)率：92%）[16，24，28，30]。

然后，將100mgPEZ溶解在50mLDMSO和250mL二氯甲烷（DCM）的混合物中。將DCM中濃度為0.2g-mL-1的SCM-PEG-SCM溶液滴加到PEZ溶液中，在25°C劇烈攪拌條件下滴加24小時(shí)，產(chǎn)生PEZ-alt-PEG[28]。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液以除去DCM，并透析（MWCO 14 kDa）對(duì)水。隨后，通過(guò)凍干得到PEZ-alt-PEG共聚物。產(chǎn)率：95%。

最后，將PEZ-alt-PEG溶于TFA中，然后加入苯甲醚和甲磺酸，室溫?cái)嚢?.5h后，用蒸餾水稀釋溶液，洗滌3次。收集水層，然后用碳酸氫鈉中和。之后，將樣品轉(zhuǎn)移到透析管（MWCO 7 kDa）中，并在5.0wt%NaHCOg水溶液下透析兩天，隨后在蒸餾水中透析五天。然后將透析產(chǎn)物凍干以獲得最終產(chǎn)物MPLL-alf-PEG。產(chǎn)量： 91 %
以DMSO-M為溶劑，在布魯克DMX 400 MHz波譜儀（德國(guó)卡爾斯魯厄布魯克）上端接P EZ和PEZ-alt-PEG的核磁共振（NMR）波譜，而MPLL-alt-PEG以D2 O為溶劑。各種cop聚合物的分子量通過(guò)配備沃特世51 5 HPLC泵和沃特世2414折光率檢測(cè)器的凝膠滲透色譜（GPC）系統(tǒng)（美國(guó)米爾福德沃特斯）測(cè)定。為了表征PEZ和PEZ-alt-PEG，使用線性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMAs）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以二甲基甲酰胺（DMF）為洗脫液分析樣品。為了表征MPLL-alt-PEG，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量，并使用0.50 M H Ac-N和Ac緩沖液（pH 4.5）作為淋洗液，線性PEG作為st標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3.載藥MPLL-alt-PEG膠束的制備與表征
為了評(píng)估MPLL-alt-PEG對(duì)小陰離子分子的封裝，將給定量的MO加入到水中的MPLL-alt-PEG溶液中（10mL）中并攪拌5分鐘。然后將獲得的溶液在下沉條件下對(duì)水透析（MWCO 50 kDa）以除去游離客體分子。在相同條件下，選擇具有等量游離MO的溶液作為透析對(duì)照。當(dāng)對(duì)照組MO溶液透析至無(wú)色時(shí)，得到MO/MPLL-alt-PEG膠束，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定透析液中MO的含量。采用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線定量0.1-6 mg-L-1濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)（r2）>0.99的MO，載藥量以MO對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比計(jì)算。

為了評(píng)估MPLL-alt-PEG對(duì)陰離子生物大分子的包封，按照?qǐng)?bào)道的方法用FITC標(biāo)記IFN[31]。隨后，將MPLL-alt-PEG和FITC標(biāo)記的IFN（FITC-IFN）溶液分別溶解在濃度為2mg-mL-1的0.01M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中。然后將1 mL IFN溶液滴加到5 mL聚合物溶液中，在超聲儀上超聲處理5 min（KQ-200 KDE，昆山超聲儀器有限公司
中國(guó)昆山，40 kHz，100 W），然后在下沉條件下用0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）透析（MWCO 100 kDa）。游離FITC-IFN在0.01M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中也作為對(duì)照進(jìn)行透析。當(dāng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的游離IFN去除后，使用FITC-IFN的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，使用FITC-IFN的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，通過(guò)Spectramax Gemini XS微孔板熒光計(jì)（分子器件合作，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾）測(cè)量外透析液中FITC-IFN的量，然后從添加的FITC-IFN總量中減去該值以計(jì)算FITC-IFN的負(fù)載量。載藥量計(jì)算為FITC-IFN對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比。

使用JEOL JEM-1400透射電子顯微鏡在100 kV的工作電壓下觀察成型膠束的形貌（JEOL，日本東京）。使用Zetasizer Nano ZS90（英國(guó)伍斯特郡馬爾文儀器有限公司）在25°C下記錄聚合物和膠束的粒徑和zeta電位。測(cè)試前使用0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將溶液稀釋至1 mg-mL-1。

2.4.pH 敏感釋放從膠束
將裝有FITC-IFN的膠束溶液（5 mL）轉(zhuǎn)移到透析袋（MWCO 100 kDa）中，然后將袋子放入150 mL的0.02 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、0.02 M HAc-NaAc緩沖液（pH 5.5）或0.02 M HAc-NaAc緩沖液（pH 4.5）中。聚合物/FITC-IFN配合溶液的制備如第2.3節(jié)所述。以預(yù)定的時(shí)間間隔，抽出給定體積的釋放培養(yǎng)基并補(bǔ)充等體積的新鮮緩沖溶液。用微孔板熒光計(jì)測(cè)定IFN的釋放量，計(jì)算藥物的累積釋放量，并繪制藥物釋放的百分比與時(shí)間的關(guān)系圖。所有實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行。

2.5.最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)量
采用肉湯微量稀釋法研究了聚合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性MRSA和革蘭氏陰性銅綠假單胞菌的抗菌活性。將細(xì)菌細(xì)胞在37°C的Mueller Hinton肉湯（MHB）培養(yǎng)基中以300rpm不斷振蕩以達(dá)到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。將微生物懸浮液稀釋并調(diào)節(jié)至2 X 105菌落形成單位（CFU）-mL-1。使用MHB對(duì)聚合物進(jìn)行一系列兩倍稀釋，細(xì)菌濃度范圍為60至0.2^M。將每種稀釋的聚合物溶液共50個(gè)加入到96孔微孔板中，然后加入50 rL細(xì)菌懸浮液，得到1 X 105 CFU-mL-1的最終接種物。在37°C孵育18小時(shí)后，用酶標(biāo)儀（Synergy HT， BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT，美國(guó)）。未添加聚合物處理的細(xì)菌細(xì)胞和未添加細(xì)菌的聚合物溶液分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。MIC被定義為18小時(shí)后抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度。

2.6.溶血測(cè)定
新鮮小鼠血液用K2EDTA處理，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次，然后以1000g離心10分鐘以分離紅細(xì)胞。然后，獲得紅細(xì)胞并用PBS（pH 7.4）稀釋至終濃度為5%（v / v）。將50 rL不同濃度的聚合物溶液與等體積的紅細(xì)胞懸浮液在96孔微孔板上混合，然后孵育1hat37°C。 以1000X g 離心10分鐘后，將上清液的等分試樣（30RL）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔微孔板中，并用100RL的PBS稀釋。

通過(guò)使用Biotek Synergy TH酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)量吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞懸浮液中血紅蛋白的釋放。用2%Triton X-100裂解的紅細(xì)胞的吸光度用作陽(yáng)性對(duì)照，并采取100%溶血，而PBS溶液中未經(jīng)處理的紅細(xì)胞懸浮液用作陰性對(duì)照。同時(shí)，應(yīng)用聚合物溶液對(duì)照樣品排除聚合物吸收干擾（假陽(yáng)性結(jié)果），并根據(jù)報(bào)告的方法檢查是否存在假陰性結(jié)果[32]。每次測(cè)試重復(fù)三次。根據(jù)以下公式（1）計(jì)算溶血百分比：
溶血 （%）=[（久樣品 — A 陰性）/0 陽(yáng)性 — 久陰性）] X 100% （1） 其中 A 樣品代表處理樣品的吸光度，^陰性代表陰性對(duì)照的吸光度，A陽(yáng)性代表陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。

本研究中的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并得到汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)（SUMC2016-200，2016年12月5日）的批準(zhǔn)。

2.7.微生物的成像研究
使用類(lèi)似于MIC測(cè)定的方案在2X MIC下生長(zhǎng)并與聚合物混合細(xì)菌細(xì)胞。在37°C孵育90分鐘后，收集細(xì)菌細(xì)胞，用PBS（5000X g，10分鐘）洗滌兩次，并在4°C下用等體積的2.5%戊二醛溶液固定4小時(shí)。 將細(xì)菌細(xì)胞在0.1M PBS（5000X g，10分鐘）中沖洗，并進(jìn)一步固定在1%鋨酸（4°C中2小時(shí)）。在0.1M PBS中沖洗后，通過(guò)分級(jí)系列乙醇（30-100%）使細(xì)胞脫水。

為了通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）觀察，將脫水樣品轉(zhuǎn)移到乙醇和乙酸異戊酯的1：1混合物中30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到絕對(duì)乙酸異戊酯中1 h。對(duì)樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，濺射涂覆一層薄薄的金，并用FE-SEM（SU8010;日立，東京，日本）。
為了通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察，將脫水樣品轉(zhuǎn)移到丙酮中20 min，轉(zhuǎn)移到丙酮和Spurr樹(shù)脂的1：1混合物中1 h，然后轉(zhuǎn)移到樹(shù)脂和無(wú)水丙酮的3：1混合物中3 h。最后，將樣品轉(zhuǎn)移到Spurr樹(shù)脂中并孵育過(guò)夜。獲得厚度為70-90nm的切片，并在TEM設(shè)置下進(jìn)行TEM觀察之前用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色10分鐘（H-7650，日立，東京，日本）。

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