流式細(xì)胞儀是一種對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選的設(shè)備。它可以快速測量、存儲和顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理和生化特征參數(shù)，并可以根據(jù)預(yù)選的參數(shù)范圍篩選出的細(xì)胞亞群。大多數(shù)流式細(xì)胞儀都是零分辨率儀器，只能測量細(xì)胞內(nèi)的總核酸、總蛋白等指標(biāo)，而無法識別和測量特定部位的核酸或蛋白量。也就是說，它的細(xì)節(jié)分辨率為零。

參數(shù)測量原理

流式細(xì)胞儀可以同時進(jìn)行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號和非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的，所謂測量區(qū)域是照射的激光束與從孔口噴出的液流束的垂直交點。當(dāng)液流中心的單個細(xì)胞通過測量區(qū)域時，受到激光照射，以2π立體角向整個空間散射光。散射光的波長與入射光的波長相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形狀、質(zhì)膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為這些生物參數(shù)還與細(xì)胞的光學(xué)特性有關(guān)，例如光的反射和折射。未染色的細(xì)胞具有散射光的特征，因此可以使用不同的散射光信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析和分類。當(dāng)然，由于光學(xué)特性的變化，固定和染色的細(xì)胞與活細(xì)胞具有不同的散射光信號。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)有關(guān)，還與散射角、收集散射光的立體角等非生物因素有關(guān)。

在流式細(xì)胞術(shù)測量中，常用兩種散射光散射方向：①前向角（即0角）散射（FSC）； ②側(cè)向散射（SSC），又稱90角散射。此時所說的角度是指激光束的照射方向與收集散射光信號的光電倍增管的軸向形成的大致角度。一般來說，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對于相同的細(xì)胞群，前向角散射光的強(qiáng)度隨著細(xì)胞橫截面積的增大而增大；對球形活細(xì)胞的實驗表明，在小立體角范圍內(nèi)基本一致。截面積的大小呈線性；對于具有復(fù)雜形狀和方向的細(xì)胞，它們可能變化很大，并應(yīng)特別注意。側(cè)向散射光的測量主要用于獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核膜的折射率更敏感，對細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒也能給出敏感的反應(yīng)。并且還可以對細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒做出靈敏的反應(yīng)。并且還可以對細(xì)胞質(zhì)中較大的顆粒做出靈敏的反應(yīng)。

實際使用時，儀器首先要測量光散射信號。當(dāng)光散射分析與熒光探針結(jié)合使用時，可以識別樣品中染色和未染色的細(xì)胞。光散射測量有效的用途是從異質(zhì)群體中識別某些亞群體。

熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子受光照射后未經(jīng)熒光染色而發(fā)出的熒光； ②特征熒光，即熒光染料發(fā)出的熒光染料被照射后與細(xì)胞結(jié)合。熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，且波長也與照射的激光不同。自發(fā)熒光信號是噪聲信號，在大多數(shù)情況下會干擾特定熒光信號的分辨率和測量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測量中，如何提高信噪比是低結(jié)合水平熒光抗體的關(guān)鍵。一般來說，細(xì)胞成分中自發(fā)熒光分子（如核黃素、細(xì)胞色素等）含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。

減少自發(fā)熒光的干擾，提高信噪比的主要措施有： 1、盡可能使用較亮的熒光染料； 2、選擇合適的激光器和濾光光學(xué)系統(tǒng)； 3. 使用電子補償電路來補償自發(fā)熒光的背景貢獻(xiàn)。