一、封閉

1.渦旋Duolink®封閉液。

2.在每個(gè)1cm2樣品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封閉液。確保封閉液要覆蓋整個(gè)樣品。

3.將載玻片置于加熱濕度箱中37℃孵育60分鐘。

二、孵育一抗在添加抗體之前請(qǐng)勿讓載玻片干燥，否則會(huì)導(dǎo)致背景。

1.渦旋Duolink®抗體稀釋劑。

2.在Duolink®抗體稀釋劑中稀釋一抗或抗體至合適濃度。

3.從載玻片上彈掉Duolink®封閉液

4.將一抗溶液添加到每個(gè)樣品中。

5.將載玻片置于濕度箱中孵育。用最佳孵育溫度和時(shí)間孵育一抗。

三、孵育Duolink® PLA探針

1.渦旋PLUS和MINUS PLA探針

2.在Duolink®抗體稀釋劑中以1:5稀釋PLUS和MINUS PLA探針。
對(duì)于40 μL反應(yīng)，取8 μL PLA探針MINUS原液，8 μL PLA探針PLUS原液和24 μL抗體稀釋劑。為所有樣品制備足量的溶液。

3.從載玻片移除一抗溶液

4.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

5.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹PLA探針溶液。

6.將載玻片置于預(yù)熱的濕度箱37℃孵育1小時(shí)。

四、連接
說(shuō)明：連接酶要等到需要添加到樣品中時(shí)立即添加。確保連接緩沖液在使用前解凍并充分混合。

1.用高純度純水以1:5稀釋5x Duolink® 連接緩沖液并混合。
對(duì)于40 μL反應(yīng)，將8 μL 5x連接緩沖液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品制備足量的溶液。

2.從載玻片移除PLA探針溶液。

3.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

 4.在洗滌過(guò)程中，使用冷凍座（-20°C）恢復(fù)從凍箱里取出的連接酶。

5.以1:40稀釋度將連接酶添加到步驟（a）中的1x連接緩沖液中，并混合。
對(duì)于40 μL連接溶液，將1 μL連接酶添加至39 μL的1x連接緩沖液中。

6.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹連接溶液。

7.將載玻片置于預(yù)熱的濕度箱37℃孵育30分鐘。

五、擴(kuò)增
說(shuō)明：聚合酶要等到需要添加到樣品中時(shí)立即添加。擴(kuò)增緩沖液對(duì)光敏感。避免所有含有擴(kuò)增緩沖液的溶液受到光照。

1.用高純度純水將5x擴(kuò)增緩沖液以1:5稀釋并混合。對(duì)于40 μL反應(yīng)，將8 μL 5x擴(kuò)增緩沖液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品制備足量的溶液。

2.從載玻片移除連接溶液。

3.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

4.在洗滌過(guò)程中，使用冷凍座（-20°C）恢復(fù)從凍箱里取出的聚合酶。

5.以1:80稀釋度將聚合酶添加到步驟（a）中的1x擴(kuò)增緩沖液中，并混合。

6.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹擴(kuò)增溶液。

7.將載玻片置于預(yù)熱的濕度箱37℃孵育100分鐘。

六、最終洗滌
說(shuō)明：光敏試劑。始終避免保存載玻片。

1.從載玻片上移除擴(kuò)增溶液。

2.在室溫下在1x洗滌緩沖液B中將載玻片洗滌2x 10分鐘。

3.在0.01x洗滌緩沖液B中洗滌載玻片1分鐘。

七、準(zhǔn)備成像
說(shuō)明：含DAPI的Duolink原位封固劑是水性的，不會(huì)凝固?？捎酶蓛舻闹讣子兔芊馍w玻片和載玻片的邊緣。避免在蓋玻片下制造氣泡。

1.拍掉載玻片上多余的洗滌緩沖液。

2.使用最小體積的含DAPI的Duolink原位封固劑，用蓋玻片蓋好載玻片。

3.等待15分鐘，然后在熒光或共聚焦顯微鏡中分析，使用至少20x物鏡。

4.成像后，可將載玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6個(gè)月。