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hellobio ICC 問(wèn)題故障排除

更新時(shí)間：2024-02-26 點(diǎn)擊次數(shù)：736

免疫細(xì)胞化學(xué)是一個(gè)漫長(zhǎng)的多步驟過(guò)程，需要考慮許多不同的因素。在某些時(shí)候，不可避免地會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題或不是最佳狀態(tài)。以下匯總了一些可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞化學(xué)不起作用的最常見(jiàn)陷阱。

問(wèn)題	潛在原因	建議的解決方案
染色弱或缺失	細(xì)胞已從蓋玻片上脫落	- 洗滌時(shí)更加輕柔或減少洗滌次數(shù)
	細(xì)胞通透性較差	- 嘗試增加 Triton X-100 的濃度
	細(xì)胞干涸	- 確保在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞始終被過(guò)量的液體覆蓋
	細(xì)胞過(guò)度固定	- 減少細(xì)胞與固定劑一起孵育的時(shí)間
	一抗太少	- 增加一抗?jié)舛?/span> - 增加孵育時(shí)間 - 考慮采用三步檢測(cè)系統(tǒng)（例如基于生物素-鏈霉親和素）
	光照	- 確保應(yīng)用二抗后樣品永遠(yuǎn)不會(huì)暴露在光線下 - 成像時(shí)盡可能使用最小曝光量并小心漂白（尤其是使用共焦顯微鏡）
	二抗錯(cuò)誤	- 確保二抗對(duì)一抗的培養(yǎng)物種具有特異性
	靶細(xì)胞中不存在蛋白質(zhì)	- 檢查文獻(xiàn)以了解細(xì)胞群中是否預(yù)期存在蛋白質(zhì) - 考慮使用陽(yáng)性對(duì)照
	表位因固定而被遮蓋	- 嘗試不同的固定劑 - 嘗試添加抗原修復(fù)步驟
	曝光時(shí)間太短	- 增加成像時(shí)的曝光時(shí)間和/或增益
高背景	非特異性結(jié)合	嘗試在沒(méi)有一抗的情況下測(cè)試二抗，以確保二抗不會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)結(jié)合
	阻擋不良	- 嘗試更換封閉液 - 嘗試增加封閉孵育時(shí)間
	抗體濃度過(guò)高	- 嘗試降低一抗?jié)舛?/span> - 嘗試降低二抗?jié)舛?/span>
	反應(yīng)性醛基	- 考慮在 PBS 孵育步驟中引入 1% NaBH4
	光譜重疊	- 確保二抗的吸收/發(fā)射光譜不重疊
	洗滌不足	- 增加二次孵育后的洗滌步驟
非特異性染色	抗體與其他蛋白質(zhì)中存在的表位結(jié)合	- 嘗試不同的抗體，看看染色模式是否相關(guān)。
	抗體濃度過(guò)高	- 嘗試降低一抗和二抗?jié)舛?/span>
	與內(nèi)源性 IgG 的反應(yīng)性	- 嘗試使用在細(xì)胞來(lái)源以外的物種中產(chǎn)生的抗體（尤其是在原代細(xì)胞培養(yǎng)物中）

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