交聯(lián)劑包含至少兩個反應(yīng)性基團，它們對包括巰基和胺在內(nèi)的許多基團具有反應(yīng)性，并在兩個或多個分子之間產(chǎn)生化學(xué)共價鍵?？捎媒宦?lián)劑靶向的官能團是伯胺、羧基、巰基、碳水化合物和羧酸。蛋白質(zhì)分子具有許多這樣的官能團，因此蛋白質(zhì)和肽可以使用交聯(lián)劑容易地結(jié)合。交聯(lián)劑用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，將蛋白質(zhì)錨定在固體支持物上，制備免疫原、免疫毒素和其他結(jié)合的蛋白質(zhì)試劑。

交聯(lián)劑可以根據(jù)反應(yīng)性基團的數(shù)量和相似性分成幾組:

• 同雙功能具有兩個相同的反應(yīng)端。

• 異雙功能具有兩個不同的反應(yīng)端。

同雙官能交聯(lián)劑用于一步反應(yīng)，而異雙官能交聯(lián)劑用于兩步連續(xù)反應(yīng)，其中最不穩(wěn)定的反應(yīng)末端首先反應(yīng)。同雙官能交聯(lián)劑具有導(dǎo)致自結(jié)合、聚合和細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)的趨勢。另一方面，異雙官能試劑允許更可控的兩步反應(yīng)，這使得不希望的分子內(nèi)交叉反應(yīng)和聚合反應(yīng)最小化。

廣泛使用的異雙功能交聯(lián)劑用于通過胺和巰基偶聯(lián)蛋白質(zhì)。最不穩(wěn)定的胺反應(yīng)性NHS-酯首先偶聯(lián)，在除去未偶聯(lián)的試劑后，繼續(xù)偶聯(lián)巰基。巰基反應(yīng)基團通常是馬來酰亞胺、吡啶基二硫化物和α-鹵代乙酰基。其他交聯(lián)劑包括碳二亞胺，它連接羧基(-COOH)和伯胺(-NH2)。存在具有一個光反應(yīng)性末端的異雙官能交聯(lián)劑。光反應(yīng)性基團在沒有特定基團可與之反應(yīng)時使用，因為光反應(yīng)性基團在暴露于紫外光時會發(fā)生非特異性反應(yīng)。

通常希望最小化由于交聯(lián)反應(yīng)引起的結(jié)構(gòu)變化的程度，如果蛋白質(zhì)分子具有生物活性則更是如此。因此，交聯(lián)是在溫和的緩沖液和pH條件下進(jìn)行的。根據(jù)應(yīng)用，結(jié)合程度也很重要，并且必須保持最佳的交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的比例。蛋白質(zhì)外表面上目標(biāo)基團的數(shù)量也很重要。如果暴露的目標(biāo)基團易于結(jié)合；可以使用較低的交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的比率。

交聯(lián)劑具有不同的間隔臂長度。當(dāng)兩個目標(biāo)基團相距較遠(yuǎn)時，可以使用具有較長間隔臂的交聯(lián)劑。具有不同間隔臂的交聯(lián)劑的可用性使得交叉反應(yīng)效率更優(yōu)化。具有短間隔臂的交聯(lián)劑適用于分子內(nèi)交聯(lián)。可切割的交聯(lián)劑也是可用的，這擴展了蛋白質(zhì)分析的范圍。

蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的選擇

當(dāng)選擇交聯(lián)劑時，要考慮以下特征:

1.試劑溶解度

2.反應(yīng)基團的性質(zhì)

3.同雙功能或異雙功能

4.光反應(yīng)性或熱反應(yīng)性基團

5.間隔臂的長度

6.共軛產(chǎn)物可裂解與否

7.進(jìn)一步標(biāo)記的可能性

8.結(jié)合所需的反應(yīng)條件

Double Do交聯(lián)劑

G-Biosciences提供多種交聯(lián)劑作為Double Do交聯(lián)劑。Double Do交聯(lián)劑系列產(chǎn)品包括化學(xué)交聯(lián)劑、由特定反應(yīng)緩沖液組成的支持附件、完整的反應(yīng)系統(tǒng)、選擇指南和方案。

為了選擇交聯(lián)劑，需要考慮幾個因素:

• 反應(yīng)方向:確定要交聯(lián)的目標(biāo)殘基，選擇不干擾蛋白質(zhì)功能的試劑。

• 膜滲透性:對于細(xì)胞表面標(biāo)記，選擇非膜滲透性試劑。

• 劈得開的:便于從固體支持物上釋放交聯(lián)蛋白或用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。

• 可逆的:可裂解試劑的替代物是可逆試劑。例如，ANB-NOS是通過光解作用釋放的。

• 空間阻礙:結(jié)合位點周圍的大基團可能需要具有更長間隔臂的試劑。